De Wet van Lambert-Beer

De grootheden "molaire extinctiecoëfficiënt", "concentratie" en "weglengte" zijn door de chemici Lambert en Beer tot een hanteerbare formule verwerkt: $E^{\lambda }\ =\ \epsilon _{stof}^{\lambda }\ *\ c_{stof}\ *\ l$

Hierin is

$E$ ^[1]	De extinctie, deze heeft geen eenheid.
$\epsilon$	De molaire extinctiecoëfficiënt in (L.mol^{- 1}.cm^{- 1}). Deze vreemd geschreven 'e' is de Griekse epsilon.
$\lambda$	De golflengte waarbij gemeten wordt, meestal aangegeven in nanometer. Als uit de omringende tekst duidelijk is bij welke golflengte gemeten wordt, dan wordt deze aanduiding vaak weggelaten. Dit vreemde teken is de Griekse letter "l", en heet lambda.
$stof$	Een aanduiding van de stof die je aan het meten bent. Als uit de omringende tekst duidelijk is welke stof gemeten wordt, dan wordt deze aanduiding vaak weggelaten.
$c$	De concentratie van de stof in mol.L^{- 1}
$l$	De dikte van de vloeistoflaag die je meet in cm.

Deze formule wordt de wet van Lambert-Beer genoemd. De regel is geformuleerd door August Beer. Hij baseerde zich daarbij op zijn eigen werk en dat van Johann Heinrich Lambert.

De waarden voor

\epsilon

is voor veel stoffen inmiddels bekend. In BINAS is van een aantal stoffen de waarde ervan opgenomen. Hier zou je mee kunnen rekenen om de concentratie van een stof in een oplossing te kunnen bepalen. In de praktijk wordt dit zelden gedaan, omdat de

\epsilon

afhangt van de exacte golflengte (en op het display van de spectrofotometer staat wel het getal dat je bedoelde, maar is dat ook werkelijk de golflengte van het licht waarmee je meet?) en de weglengte wel ongeveer, maar zelden precies 1 cm is.

Wet van Lambert-Beer

De fotometer-opstelling van Beer

De Wet van Lambert-Beer in de praktijk

De hoeveelheid licht die tegengehouden wordt, wordt gemeten met behulp van een spectrofotometer. De oplossing die gemeten moet worden wordt in een speciale houder, een cuvet, in het apparaat geplaatst. Na sluiting van de deksel wordt de extinctie op het display weergegeven.

Spectrofotometer

De huidige spectrofotometers zijn uiteraard erg geautomatiseerd. Veel van de dingen die een analist vijftig jaar geleden nog handmatig moest doen (de golflengte met een draaiknop instellen, hoeveelheden licht noteren, rekenen!) gebeuren nu automatisch. De spectrofotometer hiernaast heeft een aantal drukknoppen voor het instellen van de golflengte en de keuze voor de standaard berekeningen.
Het rechter deel van het apparaat bevat de elektronica en het bedieningspaneel.

De cuvet bevindt zich in het linker gedeelte van het apparaat. Cuvetten zijn er in veel soorten en maten. De meest gangbare maat is momenteel een cuvet met een dikte van 1 cm. Ook de breedte is 1 cm. Ook de meeste spectrofotometers zijn op deze maten ingesteld: in het cuvettenhuis zitten al houders met deze maten.

Cuvetten worden vooral van drie verschillende materialen gemaakt, afhankelijk van het gebruik dat ervan gemaakt zal worden. Er zit bovendien een aanzienlijk prijsverschil tussen cuvetten van verschillende materialen.

De leerling analist zal veel met plastic cuvetten werken. Deze zijn vrijwel onbreekbaar en kosten ongeveer € 0.10. De cuvetten hebben als nadeel dat ze alleen te gebruiken zijn met waterige oplossingen. Is er teveel organisch oplossmiddel aanwezig, dan verandert het plastic snel in matglas en kun je er niet meer mee meten. Plastic cuvetten zijn niet geschikt om in UV-licht te meten.
Glazen cuvetten zijn wel bestand tegen organische oplosmiddelen, maar zijn uiteraard wel erg breekbaar, en voor de school van de leerling-analist hebben zij het nadeel dat ze ongeveer € 20.00 kosten. Glazen cuvetten zijn niet geschikt om in UV-licht (te meten.
Kwarts-cuvetten zijn ook breekbaar en kosten ongeveer € 200.= per stuk. Deze cuvetten zijn ook geschikt om met UV-licht te meten.

Voor de meeste spectroscopische metingen voldoen deze drie soorten cuvetten. Voor speciale spectra worden ook andere materialen als cuvet gebruikt.

Cuvet

Keuze van de golflengte

De waarde van $\epsilon$ wordt niet alleen door de te meten stof bepaald maar ook door de kleur, of golflengte, van het gebruikte licht. Dit betekent dat de instelling van het apparaat heel belangrijk is. Bij elke spectrofotometer kan daarom de golflengte worden ingesteld. Er wordt altijd geprobeerd om bij een kleine verandering in concentratie een grote verandering in de tegengehouden hoeveelheid licht te krijgen. In de formule van Lambert-Beer ligt bij een bepaalde cuvet de weglengte vast.
De reactie van de extinctie op de concentratie wordt dan alleen bepaald door de de extinctiecoëfficient $\epsilon$ . Hoe groter $\epsilon$ , hoe steiler de lijn loopt. Om deze reden wordt altijd gemeten bij een golflengte waarbij de waarde van $\epsilon$ zo groot mogelijk is, het liefst maximaal.
De spectrofotometer geeft in het display van de golflengte een bepaalde waarde aan. Of dit ook echt de golflengte is van het licht dat door de cuvet gaat is lastig te controleren. Hoewel $\epsilon$ dan iets lager is, en de lijn dus iets minder steil gaat lopen, is dit vaak nog wel voldoende om een goede meting te doen. De waarde van $\epsilon$ uit BINAS kun je dan uiteraard niet meer gebruiken.

Praktisch betekent dit dat de spectrofotometer op de golflengte met de maximale

\epsilon

wordt ingesteld, en verder gedaan wordt alsof we de waarde van

\epsilon

niet echt weten.

Extinctie vs concentratie bij verschillende

\epsilon

. Rood: laag; Groen: hoog.

Om toch de concentratie te bepalen in een oplossing van bijvoorbeeld amarant, een rode kleurstof die veel in limonade wordt toegepast, wordt de volgende procedure gevolgd:

van een aantal oplossingen waarvan de concentratie amarant bekend is wordt de extinctie gemeten.
van de gemeten extincties en concentraties wordt een grafiek gemaakt. De grafiek waarin de exctinctie tegen de concentratie wordt uitgezet heet kalibratiegrafiek. De beste lijn "door" de meetpunten heet kalibratielijn. Vat "door de meetpunten" niet te letterlijk op: de beste lijn is een rechte lijn waarbij de meetpunten zo dicht mogelijk bij de lijn liggen.
ook van de onbekende oplossing wordt de extinctie gemeten.
vervolgens wordt in de grafiek gekeken welke concentratie hoort bij de gemeten extinctie.

Kalibratiegrafiek

Er wordt bewust gebruik gemaakt van een serie oplossingen, zodat eventuele toevallige fouten in het maken of meten van de oplossingen aan het licht komen. De bovenste grafiek hiernaast is het resultaat van de linker serie metingen. Hoewel de punten niet exact op een rechte lijn liggen, zijn de afwijkingen klein en waarschijnlijk het gevolg van vooral onnauwkeurigheden in de meting. In de onderste grafiek is de rechter serie metingen weergegeven. Hierin zit duidelijk een fout.