Concentratiebepaling via reactiesnelheid

Van een aantal stoffen wordt de concentratie bepaald door het effect dat ze op andere stoffen hebben. Dit geldt vooral voor stoffen die in de biologie en de medische praktijk belangrijk zijn: enzymen.

Enzymen

Voor enzymen gelden een aantal belangrijke regels en eigenschappen:

* Enzymen versnellen een reactie die anders in een levende cel erg lang zou duren. Dit verschijnsel heet katalyse, een enzym wordt ook wel een katalysator genoemd. Omdat het enzym afkomstig is uit een biologisch systeem wordt ook wel de naam biokatalysator gebruikt.

Biokatalysator

* De door een enzym gekatalyseerde reactie is specifiek. Het enzym sacharase splitst gewone tafelsuiker (

{\ce {C12H22O11}}

) wel in twee stukken, maar lactose, ook een stof met de formule

{\ce {C12H22O11}}

niet. Voor lactase geldt het omgekeerde. Hoe specifiek een enzym is hangt af van de manier waarop het enzym de stof waarop het werkt herkent. Soms wordt een groot deel van het molecuul gebruikt voor de herkenning (zoals bij sacharase en lactase) soms ook maar een klein deel. Een voorbeeld van die laatste groep is het enzym fosfatase. Dit enzym verwijdert een fosfaatgroep (

{\ce {PO4^{3-}}}

) van een molecuul

* Enzymen zijn afkomstig uit levende cellen.

* Enzymen komen in zeer kleine concentraties voor.

* Een enzym is een eiwit. De inhoud van een cel bestaat voor het grootste deel uit eiwitten. Slechts één speciaal enzym isoleren uit het grote aantal verschillende eiwitten is erg moeilijk.

Eiwit zuivering

* Enzymen kunnen alleen werken in heel nauwkeurig bepaalde omstandigheden. Je moet hierbij denken aan:

- temperatuur, vooral te hoge temperatuur. Lage temperatuur gaat meestal wel goed, zolang de oplossing niet bevriest.
- zoutconcentratie
- zuurgraad

* Worden enzymen blootgesteld aan omstandigheden die te veel afwijken van hun optimale voorwaarden dan gaan ze kapot, ze denatureren.

* Als eiwit is een enzym voor veel bacteriën een dankbare voedselbron. Het is dus nodig om steriel ( = bacterievrij) te werken.

Biologische verontreiniging

Fosfatase

Een in bloedplasma veel voorkomend, en daardoor relatief goedkoop, enzym is fosfatase. Onderstaande reactie wordt door dit enzym gekatalyseerd:

Fosfatase Reactie

${\ce {R-O-PO3^{2-}}}$	+	${\ce {H2O}}$	${\ce {->}}$	${\ce {R-O-H}}$	${\ce {+}}$	${\ce {HOPO3^{2-}}}$
Aan groot molecuul gekoppelde fosfaatgroep	+	water	geeft	Aan groot molecuul gekoppelde OH-groep	${\ce {+}}$	waterststof- fosfaat

De stof waarop een enzym werkt wordt substraat genoemd. De R staat voor een stuk molecuul dat in de normale situatie een voor leven noodzakelijke verbinding is. Het eerste atoom in R is een koolstof-atoom. Wat daar verder nog weer allemaal aan vast zit is voor het enzym niet interessant. Fosfatase herkent het molecuul aan de koppeling tussen de fosfaatgroep en iets dat met een koolstofatoom begint.

Omdat fosfatase zijn substraat herkent aan de fosfaatgroep, is het ook mogelijk een molecuul dat in geen enkele levende cel voorkomt als substraat te gebruiken. Voor fosfatase wordt gebruik gemaakt van de stof 4-nitrofenylfosfaat. Vaak wordt voor deze stof de uit het Engels afkomstige afkorting NPP gebruikt: NitroPhenylPhosphate.

Het voordeel van een molecuul dat in geen enkele levende cel voorkomt is dat vaststellen of de reactie plaatsvindt relatief makkelijk wordt: In de grote massa verschillende stoffen die in een cel kunnen voorkomen hoeft alleen gezocht te worden naar dat vreemde stofje.

Voor NNP wordt de reactie:

${\ce {O2NC6H4-O-PO3^{2-}}}$	+	${\ce {H2O}}$	${\ce {->[{\ce {Fosfatase}}]}}$	${\ce {R-O-H}}$	${\ce {+}}$	${\ce {HOPO3^{2-}}}$
NNP	+	water	${\ce {->[{\ce {Fosfatase}}]}}$	4-Nitrofenol NP	${\ce {+}}$	fosfaat

De hoeveelheid enzym kan nu bepaald worden door te kijken hoe snel NNP verdwijnt of hoe snel 4-nitrofenol (NP met de uit het Engels afkomstige afkorting NitroPhenol) ontstaat. Elk enzym-molecuul zet NPP even snel om. Zijn er twee keer zo veel enzym-moleculen, dan zal er twee keer zo veel NP gevormd worden.

Model van NPP

Reactiesnelheid meten

Net als de snelheid van een auto op meerdere manieren gemeten kan worden geldt dat ook een reactiesnelheden.

Een directe manier om de snelheid van een auto te meten is radarcontrole. Zonder de doorstroming van het verkeer te hinderen kan de snelheid van passerende auto's worden vastgesteld.
Een andere methode zou zijn om met een drone een luchtfoto van de weg te maken en dat korte tijd later weer te doen. Uit de afstand die de voertuigen hebben afgelegd in de tijd tussen de twee foto's is de snelheid te berekenen. Om vast te stellen welke auto het snelst rijdt, kun je de auto's ook allemaal op het zelfde punt tegelijk laten starten en dan na een tijdje iedereen stilzetten (of, iets vriendelijker, met een drone weer een foto maken) en kijken wie er het verst is gekomen.

De snelheid waarmee NPP wordt omgezet is vergelijkbaar met die van de auto: als de motor sneller draait (als er meer enzym aanwezig is) rijdt de auto sneller.

De snelheid van de fosfatase-reactie wordt gemeten op een manier die vergelijkbaar is met de tweede methode: je laat het enzym een tijdje zijn werk doen, en dan zet je alles stil. Dat laatste doe je door het reactiemengsel na 5 minuten sterk basisch te maken. Dit heeft twee effecten:

Het enzym wordt gedenatureerd (en werkt dan dus niet meer). Dit is vergelijkbaar met het stopzetten van de auto's in de tweede meetmethode.
Het gevormde kleurloze nitrofenol wordt omgezet in het fel geel gekleurde nitrofenolaat-ion. Visueel of met behulp van spectrometrie kan van het nitrofenolaat de concentratie, en dus de hoeveelheid, eenvoudig gemeten worden. De intensiteit van de kleur, of de extinctie is een maat voor de hoeveelheid gevormd NP. Omdat alle reacties even lang gelopen hebben, is de hoeveelheid gevormd NP een maat voor de reactiesnelheid, en daarmee voor de hoeveelheid enzym.

Meting